“Caratterizzazione funzionale di p65(-1), nuova isoforma di p65 del complesso NF-kB e preparazione di un clone per l'ingegnerizzazione di un topo p65(-1) -/-“

NF-kB è un fattore di trascrizione eucariotico e ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti in molteplici processi cellulari come la risposta immunitaria, la flogosi, l’apoptosi, la crescita cellulare e lo sviluppo embrionale. Le proteine appartenenti alla famiglia di NF-kB sono p65, c-Rel, RelB, p50 e p52. Tali proteine svolgono la funzione di fattori trascrizionali legando specifiche consensus del DNA (consensus kB) sotto forma di omo - eterodimeri. Ogni membro della famiglia di NF-kB è caratterizzato dalla presenza di un dominio, altamente conservato, il “Rel Homology Domain” (RHD). Nel RHD sono stati mappati i sottodomini di dimerizzazione, interazione con gli inibitori (IkB), traslocazione nucleare e legame al DNA. In condizioni basali i dimeri di NF-kB sono mantenuti nel citoplasma dagli inibitori IkB. La presenza di uno stimolo specifico induce il rilascio di NF-kB e la traslocazione al nucleo, dove lega sequenze promotrici e regola l’espressione dei geni target. Tra i diversi complessi di NF-kB, il p65/p50 è sicuramente il più abbondante nelle cellule e conseguentemente anche il più studiato. In uomo e in topo è stata scoperta un’isoforma di p65, chiamata p65(-1). Questa variante di splicing contiene un nuovo esone (chiamato esone -1), localizzato a monte del primo esone (esone 0) ad oggi conosciuto del gene RelA, codificante per p65. La trascrizione dell’esone -1 induce un evento di splicing tra gli esoni -1 e 1, determinando la contemporanea escissione dell’esone 0, Conseguentemente la p65(-1) presenta un RHD più piccolo rispetto a quello della controparte wild type. Numerose analisi hanno evidenziato differenze funzionali tra le proteine p65 e p65(-1), in alcuni meccanismi cellulari come l’attività trascrizionale sulle consensus kB, la regolazione dell’apoptosi e l’attivazione del recettore dei glucocorticoidi (GR). Pertanto l’obiettivo di questa tesi è di caratterizzare il ruolo di p65(-1) attraverso tre approcci: il primo in vitro, il secondo ex vivo e il terzo in vivo. Allo scopo di analizzare il ruolo come fattore trascrizionale di p65(-1), sono stati realizzati saggi luciferasi, usando alcuni promotori artificiali e naturali come NF-kB-Luc (nuclear factor kB) CRE-Luc (elementi di risposta all’cAMP), AP1-Luc (elementi di risposta di AP1), SRE-Luc (elementi di risposta al siero), HSE-Luc (elementi di risposta alle proteine da shock termico), pANXA-1-Luc (annessina 1) e pIL-6-Luc (interleuchina 6). Inoltre, le attività di p65(-1) sono state analizzate sia in termini di omodimero sia in termini di eterodimero con le proteine p65 o p50. Un’ulteriore analisi di espressione è stata condotta sulle cellule del sangue periferico umano (PBMC), in cui si dimostra che l’espressione del messaggero è sempre presente nei campioni analizzati. Inoltre i nostri dati dimostrano la presenza di profili di espressione differenti tra gli individui considerati. Infine per identificare le funzioni biologiche della nuova isoforma, vogliamo ingegnerizzare un topo KO per p65(-1). In particolare in questa sede presentiamo le possibili strategie analizzate e la realizzazione di un clone per la ricombinazione omologa per ingegnerizzare un topo transgenico caratterizzato dalla mancata espressione di p65(-1), senza alterare le funzioni di p65.Nuclear Factor-κB (NF-κB) are ubiquitous transcription factors that in mammals regulate many biological process including inflammation, immunoregulation, apoptosis, cell growth and cell proliferation. NF-kB family members include RelA (p65), c-Rel, RelB, p50 and p52. These proteins exert their functions by binding as homodimers or heterodimers to specific DNA target sites (kB consensus). NF-kBs are defined by an highly conserved amino acid domain the Rel Homology Domain (RHD), in which lie sequences for dimerization, binding to inhibitors (IkB), nuclear translocation and DNA binding. In basal conditions, NF-kB is localized in the cytoplasm complexed with its inhibitor IkB. Upon receipt of a specific signal, NF-kB is released from IkB and translocates to the nucleus to control gene expression. A new isoform of p65, named p65(-1), have been discovered in human and mouse. This isoform contains an unknown exon (named exon –1) located upstream to the first known exon of RelA, coding for p65. Transcription of the exon -1 leads to an alternative splicing between exon -1 and exon 1, thus skipping exon 0. By consequence p65(-1) has a smaller RHD than p65. Many evidences show that p65(-1), compared to p65, has different biochemical properties in some cellular mechanism like transcriptional activity on kB consensus, apoptosis and regulation of the glucocorticoid receptor (GR) activation. Therefore the aim of this study is to characterize the function of p65(-1) by an in vitro, ex vivo and an in vivo approach. In order to test the transcriptional role of p65(-1) we have analyzed the transactivation of p65(-1) using both artificial and natural promoter regions, linked with the pathway of NF-kB. We have performed luciferase assays with NF-kB-Luc (nuclear factor kB) CRE-Luc (cAMP response element), AP1-Luc (AP1 response element), SRE-Luc (serum response element), HSE-Luc (heat shock protein response element), pANXA-1-Luc (annexina 1) e pIL-6-Luc (interleuchin 6) to study the activity of p65(-1) and we have also analized p65(-1) activity with p65 or p50 under the same conditions. We have also studied p65(-1) expression on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC); it is shown that the expression of mRNA is always present in the analyzed samples. In addition, our data demonstrate different expression profiles between individuals considered. We are also engineering a mouse p65(-1)-/-. Here we show the strategy we used to engegnire the homologous recombination vector to knock out p65(-1) expression without affecting p65 function